核酸是生物的遗传物质，也是分子诊断的基石，传统的核酸提取方法一般会使用无机或者有机物裂解细胞，释放核酸，然后再使用一些方法对其进行分离，达到核酸提取的目的，比如热裂解、碱裂解、超声裂解等等。随着纳米磁珠、硅胶膜等材料的使用，核酸提取进入了自动化的时代，基于硅胶膜的柱离心法因为操作麻烦已经使用比较少了，基于磁珠的核酸提取方法成为主流。从产品设计上，核酸提取仪可以分为上吸式和下吸式，也就是通过转移磁珠完成提取的我们叫上吸式，转移液体完成提取的叫下吸式。从产品功能上，可以分为半自动核酸提取仪和全自动核酸提取工作站，前者使用预装板完成提取，需要手工加样和转移核酸，通量多以12的倍数为单位，12、24、36、48、96样本通量为主；比较流行的产品有GeneRotex全自动旋转核酸提取仪、NP968-S核酸提取仪、EX3600等等，这次新冠疫情过后，基本上各个PCR实验室都配备了核酸提取仪，而且也出现了很多的新产品，在设计和功能上更完善。全自动核酸提取工作站和半自动核酸提取仪的最大区别在于，全自动的工作站能够完成从样本到PCR上机前的所有操作（加样、提取、体系配置），以前的时候还需要手工开盖，现在各种分杯系统的上市，开盖都是机器操作了，更加智能。比较流行的品牌有天隆科技的9600E、圣湘的Natch CS、之江的Autrax等，进口的产品有罗氏的4800，PE、豪洛捷等品牌。经历过前面的核酸提取之后，就进入到核酸检测的环节，这个环节的主要设计的仪器是PCR仪，PCR仪根据其功能可以分为以下3种：定性PCR仪、荧光定量PCR仪和数字PCR仪。定性PCR仪是最早的一个产品，主要的功能是根据设置好的温度梯度完成核酸的扩增，它的出现取代了最早PCR实验需要用梯度水浴锅的尴尬处境。简单来说这就是个“温控系统”，所以市场售价也比较便宜。比如Genesy-96T、iCyling 96梯度PCR仪、Life Touch基因扩增仪等。荧光定量PCR仪的组成相比较定性PCR仪升级最大的就是增加了光学系统，而且其扩增体系和PCR原理也有所不同，增加了荧光染料或者荧光探针，通过信号变化实时监控整个PCR的过程。把扩增和检测的功能集成到了一起，闭管反应，大大降低了污染的风险。这块国内做的好品牌有上海宏石、杭州博日、达安基因、天隆科技、雅睿、安杰思等，国外主流品牌有ABI、伯乐、罗氏、赛沛等等。在这里也教大家一个在实验室里区分定性PCR仪和定量PCR仪的方法，看它连不连电脑，一般定性的都是机器自己带屏幕，定量的需要连个电脑，仅供参考。数字PCR仪是PCR仪领域新兴的一个技术产品，主要特点是能够绝对定量、具有超高灵敏度，其采用了微流控+微纳米制造技术能够将溶液分散成单独的微反应单元，配合软件算法实现了真正的绝对定量。国外市场主要以伯乐、赛默飞的数字PCR为主流，国内数字PCR产业发展迅速，目前已经有杭州领航、新羿生物、臻准生物、顺德永诺、小海龟等一批企业和产品陆续上市。
此前很多人问我说，你觉得数字PCR仪会取代荧光PCR仪么，我个人觉得不太可能，成本是一方面，另一方面是真正的临床应用并不一定需要这么精准的检测技术。而凭借数字PCR技术精准的优势，其应用领域未来会集中在移植排斥游离DNA监测、液体活检、NIPT等方向。就像杀鸡用菜刀，杀牛用电刀，非要用个电刀去杀鸡也没什么必要。
基因测序是当下比较火的分子诊断技术领域之一，通过尽可能多的得到被测物中的核酸序列，进而分析其能带来的价值，目前基因测序技术一定发展到第四代，第一代测序技术是非常经典的Sanger测序（双脱氧核苷酸末端终止测序法），目前市面还能看到的商品化产品有海尔施的呼吸道13联检，是Sanger测序配合毛细管电泳做的产品；
第二测序技术目前应用最为广泛，其最显著的特点就是高通量，市场上主要的玩家是Illumina、华大基因等，当然基于再研发的服务类公司就很多了；第三代测序技术也叫单分子测序技术，它解决了一代和二代在测序前的文库制备和PCR扩增步骤，如果我们全流程来看分子诊断，三代之前的测序都是放在经过PCR仪器处理之后来完成，但是第三代测序技术就把测序放在了和荧光定量PCR仪平行的位置上，这个改变带来的最大好处就是测序技术的门槛降低，更加普适化。
第四代测序技术严格意义上讲，其属于第三代技术的一个升级版，姑且可以叫第3.5代技术，但其带来的飞跃也是明显，主要体现在对检测设备的成本控制上，其采用了纳米孔检测技术，使得信号的捕捉不再依赖高速摄像机或者高分辨的CCD相机。
基因芯片技术也可以叫核酸芯片、微阵列芯片等，是目前应用最为广泛的一种生物芯片技术，将设计好的核酸片段有序的固定在固相支持物上，然后是其与PCR扩增之后的产物进行杂交，通过检测信号来判读结果。
基因芯片技术相比于荧光PCR技术而言，解决了检测靶标通量的问题，一张芯片能够集成非常多的检测靶点，这就使得这项技术在基因突变、细菌耐药方面具有极大的优势，现在主要的玩家有博奥、凯普、亚能、博晖创新等。
原来基因芯片的临床应用多放在PCR4区进行，需要经过PCR扩增之后再拿去做杂交，而博奥、博晖创新等自动化产品的让基因芯片有了更大应用场景，自动化也是基因芯片未来的主航道。
分子POCT仪器属于是当下比较火的细分领域之一，行业对其更多的期望是能够走出实验室，面向基层，面向临床科室市场，但是这一路其实并不好走。有兴趣的可以翻翻IVD从业者网的历史文章，有很多相关资料。分子POCT目前有几个热门技术方向：微流控、微液滴、芯片、核酸快检等等。主要已经上市的品牌有优思达、博奥晶芯、奥然、百康芯、万孚倍特等等，国内做的非常成功的有赛沛的GeneXpert系统、梅里埃的Flimarray系统等。感觉分子诊断火了之后，很多细分技术和领域也跟着都火了，核酸质谱就是其中一个，质谱的原理就是将样品分子离子化，然后在电场中施加力的作用，使其分离，进而得到质谱图谱。核酸质谱使用的质谱电离技术主要还是采用ESI和MALDI，两个都是软电离，目前市面上的核酸质谱仪主要有安图的Autof ms1000、Clin-TOF II临床飞行时间质谱系统和中元汇吉质谱仪EXS3000等。这是一个经常被遗忘的分子诊断细分领域，因为产品主要都应用在病理科，与主战场检验科隔行了，所以关注度并不高，市场上玩家也比较少。和PCR、NGS相比，FISH技术在染色体数目、结构异常、基因缺失、重排以及基因融合等方面具有独特的优势。FISH检测也是检测乳腺癌Her-2基因和肺癌ALK基因断裂的金标准，其适用的仪器设备主要是荧光显微镜。
2021-04-30
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