浅谈肿瘤体外诊断试剂的临床试验设计

     肿瘤是一种高发病率和高死亡率的疾病，严重威胁人类的生命健康。近年来，随着体外诊断试剂在国内的迅速发展，极大地推动了肿瘤标志物在临床诊疗中的运用，对肿瘤的辅助诊断、观察疗效以及预后评价等具有重要的临床应用价值。但是由于目前临床常用肿瘤标志物存在灵敏度和特异度不高，绝大多数肿瘤标志物的浓度高低与肿瘤的大小、生长、恶性程度以及分级/分期虽有一定关联但缺乏大样本临床试验证据等问题，使肿瘤体外诊断试剂的研究面临着新的挑战和机遇。那么我们就需要根据国家的法律法规、技术指导原则等要求，设计更加完善、可靠的试验方案，尤其要注意针对个体化治疗伴随诊断试剂的特点，建立合理和有效的临床评价体系，更大程度地推动国产化肿瘤体外诊断试剂的临床应用进程和提高我们肿瘤诊疗的整体水平。

     从1990年起，我国卫生部发出的“关于调查临床检验体外诊断试剂生产单位基本情况的通知”，2007年中国国家食品药品监督管理局(CFDA)正式颁布实施《体外诊断试剂质量管理体系考核实施规定（试行）》、《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》和《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》等法律法规，进一步加强了我国对体外诊断试剂质量管理体系的监督管理及明确了体外诊断试剂的产品分类、临床试验、注册检测、质量管理体系和注册申请等方面的内容。可以说，2007年为我国体外诊断试剂监管历史上最为重要的一年，在随后的几年我国体外诊断试剂进入到飞速发展的时代，推动了体外诊断试剂在临床诊疗过程中的运用。

     体外诊断试剂按检测原理或检测方法，主要分为生化诊断试剂、免疫诊断试剂、分子诊断试剂、微生物诊断试剂、尿液诊断试剂、凝血类诊断试剂、血液学和流式细胞诊断试剂等，其中生化、免疫、分子诊断试剂为我国诊断试剂主要的品种。按产品风险程度的高低，体外诊断试剂又可分为第三类、第二类和第一类产品。肿瘤体外诊断试剂即肿瘤标志物检测相关的试剂属于第三类产品。肿瘤体外诊断试剂的发展对于肿瘤筛查、诊断、疗效观察、预后评估、用药调整等具有重要的临床实践指导意义。肿瘤体外诊断试剂有别于其他诊断试剂的特点：随着肿瘤的发生发展，肿瘤细胞中的基因可能会发生改变，对于肿瘤生物标志检测阳性，还不能直接指导临床诊治。同时，肿瘤是一种多基因疾病，单个肿瘤标志物的灵敏度欠佳。现常用的肿瘤标志物特异度低，既存在肿瘤中，也存在正常人群中。从国内所进行的肿瘤标志物检测研究，部分的实验设计存在一定缺陷，相同的肿瘤诊断试剂在不同研究中的阳性率差异大，选择入组样本例数少，中晚期病例多，早期病例少，统计学分析欠缺，多为横断面研究，缺少队列研究等，致使研究得出的结论很难充分说明问题，一定程度上阻碍了肿瘤体外诊断试剂的临床推广和应用。因此肿瘤诊断试剂应向着合理的临床设计、提高灵敏度和特异度、重复性好、一个样本多个指标联合检测和适合推广等方向进行改进。

     在临床设计的过程中，需要遵循以下几点的要求，完善临床设计。

（一）临床研究机构的选择

     肿瘤体外诊断试剂的临床研究需选定不少于3家（含3家）省级医疗卫生单位。临床研究机构必须具相应专业的技术人员、检测的实验室和检测仪器设备等，申办方需要和临床机构检测部门进行良好的沟通，对相关人员进行培训。在正式检测前，需进行方法学验证，保证操作人员的熟练性。同时，每个临床机构需要注意保存检测原始数据，确保数据的真实性和可溯源性。具有药品临床试验管理规范( Good Clinical Practice, GCP)中心的医疗机构可优先考虑，因其有相对健全的管理流程、专业的研究队伍等保证试验规范的顺利进行。通过中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment ,CNAS)认可的检测实验室亦可优先考虑。

（二）临床试验方案的制定

     1．试验评估的内容：体外诊断试剂研发过程中，需要评估试剂分析性能如最低检出限、检测范围、精密度、特异度、稳定性和Hook（钩状）效应等。临床验证过程中，需要对其临床性能如临床灵敏度、临床特异度、临床符合率（预测值、拟然比）等进行评估。

     2．样本的选择：目前临床常用的样本主要为血清、血浆、胸水、组织切片和骨髓等，我们需要根据检测的内容选择合适的临床样本。同时，不同类型的肿瘤细胞、肿瘤标志物的表达量、基因表达水平或阳性率等各不一样。还需要有针对性的验证试剂所适用的肿瘤类型，最大程度地提高临床灵敏度和特异度。从而明确试验的入组标准和排除标准。在临床试验实施过程中，严格按照方案中的标准执行。

     3．研究对象的分组：新的肿瘤诊断试剂，病例组是需要使用金标准明确诊断肿瘤类型，病理学确诊为最佳的金标准用以区分“有病”和“无病”。对照组亦需要使用金标准证实为未患有该肿瘤或为健康人群。观察组应尽量包括肿瘤的各个分期，各个年龄段，性别均衡，以便能反映该病的全部特征；对照组除正常健康志愿者外，最好还要包括良性肿瘤或炎症对照组，可以增加检测结果的特异度。同时，在试验设计过程中还应注意考虑将观察组和对照组一些基本参数（例如，性别、年龄）相匹配，使两组数据具有可比性。对照组和观察组同时检测，测定结果与金标准判断结果符合或差异程度的统计学指标，再根据这些指标对新产品进行评价。

     对于“已有同品种批准上市”的肿瘤诊断试剂临床研究，采用待考评试剂与对照试剂法同时进行对比试验研究。考察两种试剂的阳性符合率、阴性符合率及一致性，分析待考评试剂的临床性能。对比试验研究中测定结果不符的样本应采用金标准或其他方法（或试剂）再次进行确认试验。以笔者实验室进行的一项临床研究为例，在108例乳腺癌组织标本，比较了进口Path V ysion HER2试剂盒和国产金菩嘉GP HER2试剂盒检测乳腺癌患者HER2基因状态。同时，评价了GP HER2试剂盒在捡测乳腺癌患者组织标本中HER2基因状态的灵敏度和特异度、准确性和卫生经济学价值。

     4．样本量的确定：在确保具有统计学意义的基础上选择恰当的样本量，肿瘤体外诊断试剂的临床研究的总样本数至少为1000例，动态监测样本量不少于100例。以笔者实验室完成的热休克蛋白90a( HSP90a)定量检测试剂盒的临床验证为例，共入选样本2284例。国内一项多中心肝癌血清DKK1肿瘤标志物的检测，共入选样本1284例，研究结果发表在Lancet Oncology杂志上。罕见病、特殊病种及特殊情况可酌减样本量，但应说明理由，并满足评价的需要。如采用放射性核素标记的体外诊断试剂，临床研究总样本数至少为500例。

     5．样本的采集：根据样本选择的种类，明确样本的采集要求。如全血样本，需明确选择何种抗凝剂、处理条件、存储条件等，并注意考察外源性物质如抗凝剂或内源性物质如溶血、乳糜等对于检测结果的影响。尽可能采用新鲜样品进行检测，如无法避免使用贮存样品时，注明贮存条件及时间，避免反复冻融样本，影响检测的准确性。观察组和对照组样本种类及其检测条件要求一致。

     6．采集时间点：以全血样本采集为例，非动态样本的采集为患者处于特定肿瘤负荷阶段的状态下采集的样本。动态样本的采集分为经手术治疗和内科治疗的样本，手术治疗采集的时间点通常为手术前、手术后1周内、临床疗效评价前后等。内科治疗采集时间点主要为治疗开始前、治疗开始后每个治疗周期结束时，收集至4个治疗周期结束，通常采集5次样本。以笔者实验室完成的热休克蛋白90a( HSP90a)定量检测试剂盒的临床验证为例，手术治疗样本采集的时间点主要为手术前、手术后一周内、临床疗效评价前后，采集3次样本。内科治疗样本采集时间点主要为治疗开始前、治疗开始后的每个治疗周期结束时，收集至4个治疗周期结束。

（三）伦理审查

     在临床试验设计过程中，必须符合赫尔辛基宣言的伦理学准则，以患者的利益作为根本，需明确获得或研究对受试者的风险性。将试验方案提交伦理委员会，并获得伦理委员会的审查意见及受试者的知情同意书。同时，存在客观上不可能获得受试者的知情同意或该临床研究对受试者几乎没有风险，可向伦理委员会提交免签受试者的知情同意书，但也需要临床研究者在相关伦理委员会备案，并提供有关伦理事宜的说明。临床试验方案有改版或更新，要在伦理委员会进行备案。

（四）临床试验的实施

     在临床试验实施的过程中，申办方将试剂盒移交检测实验室，检测实验室需对试剂盒的检测方法进行方法学验证，包括精密度和准确度、稳定性等，充分保证试剂盒在符合要求的前提下，进行临床样本的检测。同时，完善干扰性物质如外源性物质（抗凝剂等）和内源性物质（溶血、乳糜等）对于检测结果影响的研究，在临床样本检测过程中，剔除影响检测结果的相关样本。同时，在临床试验开始后，每个临床试验中心需严格按照入组标准、排除标准和剔除标准进行样本的选择，同时每个中心样本收集方法、处理方式、冻存条件、样本转运等要有统一明确的操作规范，收集的样本需要准确记录患者入组号、标本采集时间、实验室检测结果、临床初步诊断等，做好质量控制。同时，需要有第三方机构定时对试验进行监督和审核，确保临床试验的真实性和有效性。

（五）统计学的分析

     作为临床试验过程中的一个环节，统计学的处理分析至关重要。首先，要确保原始数据真实性及完整性，对于缺失的数据不可进行填补，同时，收集并分析检测样本的一般临床特征。以定量检测试剂为例，一般采用SPSS或是SAS统计软件进行分析，所有统计检验均采用双侧检验，以p<0.05为差异有统计学意义，组间比较通常采用t检验/秩和检验。且需要使用ROC曲线下面积，确定最佳cut-off值，并以灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值、阴性预测值等指标评价新肿瘤检测试剂的诊断性能及临床有效性。已有同类产品的肿瘤诊断试剂，需要阳性符合率、阴性符合率、Kappa一致性检验。

（六）临床试验报告

     临床试验报告应对试验的整体设计给予清晰和完整的阐述，包括试验设计、研究方法选择、所有原始数据、统计分析方法、讨论和结论等。

     综上所述，科学的临床研究设计、分析方法及统计分析方法，以及实验的质量控制对于肿瘤体外诊断试剂研发至关重要。因此，检验同仁需要认真研读法律法规，遵循法规的基本要求，认真落实在临床试验的每一步过程中，确保实验的真实性和有效性。从而推动国产化肿瘤体外诊断试剂的临床应用进程和提高我国肿瘤诊疗的整体水平。